Volume 17, Number 1
Clinical Article
Visy M, MD; Ujhelyi E, MD; Berki T, MD; Lustyik G, MD; Grama L, MD; Falus A, MD
A CD4+T sejt alcsoporton a megnövekedett glukokorticoid kötés és a szteroid
érzékenység összefüggése nephrosis szindromában.
Összefoglalás.
Lymphocyták glukokortikoid-receptorait (GCR) vizsgáltuk 18 nephrosis szindrómában
szenvedo gyermeknél és 4 hasonló korú olyan gyermeknél, akiknek nem volt
vesebetegségük. Flow cytometriával mértük a monoklonális ellenanyaggal jelzett
pozitív GCR-eket. Elemeztük a GCR, a CD3, a CD4 és a CD8 lymphocyták számát. A GCR+
sejtek aránya mindegyik csoportban összefüggést mutatott a szteroid érzékenységgel.
A CD4+ sejtek arányának mértéke a CD8+ sejtekéhez képest alacsonyabb volt a
szteroidra nem érzékeny, és magasabb a szteroidra érzékeny gyermekeknél.
Bevezetés
A nephrosis szindrómában szenvedo gyermekek kortikoszteroidokkal történo
kezelésének jelentoségét 50 éve ismerik. Mindig voltak olyan gyermekek, akik nem
reagáltak kelloképpen a szteroid kezelésre annak ellenére, hogy eleinte úgy tunt,
hogy a szteroid-érzékenyekéhez hasonló szövettani és klinikai jellemzoik voltak. A
szteroid kezelésre jól reagáló gyermekek esetében
is elofordul, hogy a kezelésnek káros hatása van. Az elmúlt tíz év során
tanulmányoztuk a szteroid érzékenységet szabályozó tényezoket. Ismeretes, hogy az
intracelluláris glükokortikoid receptorok szintjének kimutatása és nyomon követése hasznosnak bizonyult számos klinikai
és kísérleti modell esetében. Eloször olyan nephrosis szindrómában szenvedo
gyermekeknél vizsgáltuk a lymphocyták GCR-t izotóp kötés elemzésével (3H
triamcinolone acetonid), akik korábban nem kaptak
kezelést. Kezdeti vizsgálataink azt jelezték, hogy pozitív korreláció van a szteroid
érzékenység és a lymphocyták GCR száma között. Jelen tanulmányunkban bemutatjuk a
T-sejtcsoportokon levo glükokortikoid receptor pozitivitás és a szteroid érzékenység
összefüggésére vonatkozó vizsgálati eredményeinket.
Betegek és módszerek
Összesen 18, 8-17 éves gyermeket, köztük 8 fiút és 10 lányt vizsgáltunk.
Mindegyik nephrosis szindrómában szenvedett (súlyos proteinuria >
0,05 g/kg/nap, szérumalbumin < 25g/l és változó
ödéma). A vizsgált betegek közül egynél (7. számú beteg), a nephrosis szindroma a
Henoch-Scholenlein betegség prezentációs tünete volt.
A 4 kontroll: két fiú és két lány, 9-13 évesek voltak, az és ambuláns
rendelésen jelentkeztek, nem szenvedtek vesebetegségben. A
mintavétel idején, valamint azt megelozo 2 héten belül egyik gyermek sem kapott
kortikoszeroid kezelést.
A vizsgált 18 beteg gyermeket három klinikai csoportra osztottuk szteroid
érzékenységük szerint: jól reagálók n=7, közepesen reagálók n=5 (kezdetben jó volt a válaszkészségük, de késobb más, vagy
kiegészíto kezelést igényeltek), nem reagálók n=6 (nem sikerült remissziót elérni
szteroid kezeléssel, 4 beteg esetében a biopsziánál minimális elváltozás
találtunk, 2 beteg pedig mesangiocapilláris glomerulonephritisben szenvedett).
Felhasznált anyag
Fikoeritrinnel (Phycoerytrin, PE) jelzett anti-humán CD3, CD4 és CD8 és izotípus
kontrol monoklonális ellenanyagokat (DAKO) alkalmaztunk a sejtfelületi markerek
kimutatására. Fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC)
konjugált anti-GCR monoklonális ellenanyag (eloállítója: a Pécsi Orvostudományi
Egyetem Immunológiai és Biotechnológiai Tanszéke) alkalmazásával vizsgáltuk a GCR-t
PBMC-ben. FITC-szel jelzett egérben termelt IgG1 izotóp kontrolt (Becton Dickinson)
használtunk kontrol mintaként.
Festo puffer: foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS), amely
0,1 % BSA-t és 0,1 % NaN3-at tartalmaz.
Fixáló puffer: 4 %-os pufferolt paraformaldehid (PFA) PBS-ben oldva.
Permeabilitás elosegítésére alkalmazott puffer: 0,1
%-os szaponint tartalmazó festopuffer. Mindegyik komponenst a SIGMÁ-tól szereztük be.
Flow Cytometria
A periferiális vér lymphocytáinak intracelluláris GCR-festését Berki és társai
leírása (1998) szerint végeztük. Röviden, alvadásukban heparinnal gátolt friss vérmintákat használtunk a lymphocyták izolálására Ficoll
Paque (Pharmacia) gradiensen. Két egymást követo mosási lépés után 100m l kötopuffer-oldatban
kémcsövenként 106 sejtet festettünk meg
a megfelelo koncentrációjú PE-vel jelölt felületi marker-specifikus mAb (anti-CD3
vagy CD4 vagy CD8) 30 percen keresztül, jégen. Két mosási fázis után a sejteket
fixáltuk 4 %-os PFA/PBS-pufferben 20 percig. Ezután a mintákat permeabilizáltuk és
festettük a megfelelo koncentrációjú anti-GCR mAb-bal további 30 percig. A permeabilizáló
és a mosó pufferben való mosási fázisok után a mintákat mértük és elemeztük egy
Becton Dickinson FACS Calibure készülékkel. Ún. List mode file"-okat
elemeztünk FCAP-list programmel (FCAP-list software for Flow Cytometry Data Analysis and
Processing, amelyet a Soft Flow Hungary Ltd. 1997. (ISBN 963047843 9). Az anti-GCR FITC
festést mindig összevetettük az izotípus-FITC kontrol mintákkal. Megszámoltuk a 18
tagú betegcsoport és a 4 tagú kontrol csoport esetében a CD3, a CD4 és a CD8 pozitív
sejteket és azok (CD3, CD4 és CD8 pozitív lymphocyták) glükokortikoid receptor
pozitív (GCR+) hányadát. A statisztikai elemzést Student-féle t-próbával és
ANOVÁ-val végeztük.
Eredmények
A három klinikai csoport és a kontrollcsoport abszolút adatait, a CD3, a CD4 és a
CD8 sejteket valamint mindegyik csoport GCR pozitivitását az 1-4. Táblázat
tartalmazza. A CD3, a CD4 és a CD8 arányok, valamint a CD4/CD8-arány nem mutatott
összefüggést a szteroid kezelésre mutatott klinikai reakcióval. Bár, a GCR+ sejtek
aránya mindegyik csoportban korrelált a szteroid érzékenységgel (1. ábra). Így, a
szteroidra jól reagálók GCR+CD4/CD4 aránya 26,11 %, és a GCR+CD8/CD8 aránya 5,42 %
volt, míg a nem érzékenyek esetében ugyanezek az arányok 2,52 % és 21,38 % voltak. A
két arány összevetése, vagyis a CD4+/CD8+ arányok számítása esetén a szteroidra
jól reagálóknál 6,32, a közepesen reagálóknál 1,16 és a rosszul reagálóknál
0,78 volt. A kontrol csoportnál az arány 1,03 volt. A GCR pozitivitás a teljes T-sejt
(CD3) csoportban nem mutatott korrelációt a szteroid kezelésre való klinikai
válaszkészséggel.
Megbeszélés
1974-ben Shalhoub foglalkozott eloször az idiopathiás nephrosis szindroma és a T
sejt funkció zavar összefüggésével. Fodor és társai késobb feltételezték, hogy a
gyermekek minimal change" nephrosis szindrómájában szerepet játszik
egy T-sejt funkciót befolyásoló szérumfaktor. Fiser és társai vizsgálták a
T-lymphocyta alcsoportokat flow cytometriás elemzéssel nephrosis szindrómában szteroid
kezelés alatt és steroid kezelés nélkül.. Vizsgálataik
a rendellenes T-sejtvonalak kóroktani szerepére utaltak, de ezeknek a lymphocytáknak
funkcionális szerepe nem tisztázódott. Ezeket követoen részletesebben
tanulmányozták a nephrosis szindrómában szenvedo, szteroid érzékeny és szteroid
rezisztens gyermekeknél a T-sejt elváltozást, és
úgy találták, hogy több különbözo immun-mechanizmust muködik közre az idiopatikus
nephrosis szindróma patogenezisében. Ismeretes, hogy a glükokortikoid receptorok száma
alapveto a glükokortikoid hatás kiváltásában.
Ezen túlmenoen, a szteroid érzékenység vizsgálata fontos, mert befolyásolja a
kezelési protokollt. Vizsgálatunk arra mutat, hogy a GCR+CD4/GCR+CD8-arány ismerete
hasznos alapul szolgál a kezelési lehetoségek értékelésénél. Magas arányok
esetében valószínusítheto a szteroid
érzékenység, viszont ott, ahol az arány kisebb, mint 2, a szteroid kezelésre nem
várható kielégíto válasz. Úgy véljük, hogy a T-sejtvonalak GCR-pozitivitásának
elemzése hasznos útmutató a nephrosis szindrómában szenvedo gyermekek személyre
szabott kezelésének megválasztásánál a betegségük teljes folyamatában.
1. ábra - Glükokortikoid kötéssel rendelkezo (GCR+) sejtek (átlag, ± SEM) a CD4 (A) és a CD8 (B) pozitív T-sejteknél. A
GCR+CD4+/GCR+CD8+ sejtek arányát mutatja az 1C ábra. 1: szteroid
kezelésre jól reagálók, 2: közepesen reagálók, 3: nem reagálók, 4:
kontrolcsoport. A részletekrol lásd: Anyag és Módszer. *:p<
0,05, **:p< 0,01 (ANOVA).
|