IP CME  - Click Here

 

Home | Current Issue | Archives | International Articles | CME | E-Abstracts

 

Volume 17, Number 1

Clinical Article

Visy M, MD; Ujhelyi E, MD; Berki T, MD; Lustyik G, MD; Grama L, MD; Falus A, MD


A CD4+T sejt alcsoporton a megnövekedett glukokorticoid kötés és a szteroid érzékenység összefüggése nephrosis szindromában.

Összefoglalás.

Lymphocyták glukokortikoid-receptorait (GCR) vizsgáltuk 18 nephrosis szindrómában szenvedo gyermeknél és 4 hasonló korú olyan gyermeknél, akiknek nem volt vesebetegségük. Flow cytometriával mértük a monoklonális ellenanyaggal jelzett pozitív GCR-eket. Elemeztük a GCR, a CD3, a CD4 és a CD8 lymphocyták számát. A GCR+ sejtek aránya mindegyik csoportban összefüggést mutatott a szteroid érzékenységgel. A CD4+ sejtek arányának mértéke a CD8+ sejtekéhez képest alacsonyabb volt a szteroidra nem érzékeny, és magasabb a szteroidra érzékeny gyermekeknél.

Bevezetés

A nephrosis szindrómában szenvedo gyermekek kortikoszteroidokkal történo kezelésének jelentoségét 50 éve ismerik. Mindig voltak olyan gyermekek, akik nem reagáltak kelloképpen a szteroid kezelésre annak ellenére, hogy eleinte úgy tunt, hogy a szteroid-érzékenyekéhez hasonló szövettani és klinikai jellemzoik voltak. A szteroid kezelésre jól reagáló gyermekek esetében is elofordul, hogy a kezelésnek káros hatása van. Az elmúlt tíz év során tanulmányoztuk a szteroid érzékenységet szabályozó tényezoket. Ismeretes, hogy az intracelluláris glükokortikoid receptorok szintjének kimutatása és nyomon követése hasznosnak bizonyult számos klinikai és kísérleti modell esetében. Eloször olyan nephrosis szindrómában szenvedo gyermekeknél vizsgáltuk a lymphocyták GCR-t izotóp kötés elemzésével (3H triamcinolone acetonid), akik korábban nem kaptak kezelést. Kezdeti vizsgálataink azt jelezték, hogy pozitív korreláció van a szteroid érzékenység és a lymphocyták GCR száma között. Jelen tanulmányunkban bemutatjuk a T-sejtcsoportokon levo glükokortikoid receptor pozitivitás és a szteroid érzékenység összefüggésére vonatkozó vizsgálati eredményeinket.

Betegek és módszerek

Összesen 18, 8-17 éves gyermeket, köztük 8 fiút és 10 lányt vizsgáltunk. Mindegyik nephrosis szindrómában szenvedett (súlyos proteinuria > 0,05 g/kg/nap, szérumalbumin < 25g/l és változó ödéma). A vizsgált betegek közül egynél (7. számú beteg), a nephrosis szindroma a Henoch-Scholenlein betegség prezentációs tünete volt.

A 4 kontroll: két fiú és két lány, 9-13 évesek voltak, az és ambuláns rendelésen jelentkeztek, nem szenvedtek vesebetegségben. A mintavétel idején, valamint azt megelozo 2 héten belül egyik gyermek sem kapott kortikoszeroid kezelést.

A vizsgált 18 beteg gyermeket három klinikai csoportra osztottuk szteroid érzékenységük szerint: jól reagálók n=7, közepesen reagálók n=5 (kezdetben jó volt a válaszkészségük, de késobb más, vagy kiegészíto kezelést igényeltek), nem reagálók n=6 (nem sikerült remissziót elérni szteroid kezeléssel, 4 beteg esetében a biopsziánál minimális elváltozás találtunk, 2 beteg pedig mesangiocapilláris glomerulonephritisben szenvedett).

Felhasznált anyag

Fikoeritrinnel (Phycoerytrin, PE) jelzett anti-humán CD3, CD4 és CD8 és izotípus kontrol monoklonális ellenanyagokat (DAKO) alkalmaztunk a sejtfelületi markerek kimutatására. Fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) konjugált anti-GCR monoklonális ellenanyag (eloállítója: a Pécsi Orvostudományi Egyetem Immunológiai és Biotechnológiai Tanszéke) alkalmazásával vizsgáltuk a GCR-t PBMC-ben. FITC-szel jelzett egérben termelt IgG1 izotóp kontrolt (Becton Dickinson) használtunk kontrol mintaként.

Festo puffer: foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS), amely 0,1 % BSA-t és 0,1 % NaN3-at tartalmaz.

Fixáló puffer: 4 %-os pufferolt paraformaldehid (PFA) PBS-ben oldva.

Permeabilitás elosegítésére alkalmazott puffer: 0,1 %-os szaponint tartalmazó festopuffer. Mindegyik komponenst a SIGMÁ-tól szereztük be.

Flow Cytometria

A periferiális vér lymphocytáinak intracelluláris GCR-festését Berki és társai leírása (1998) szerint végeztük. Röviden, alvadásukban heparinnal gátolt friss vérmintákat használtunk a lymphocyták izolálására Ficoll Paque (Pharmacia) gradiensen. Két egymást követo mosási lépés után 100m l kötopuffer-oldatban kémcsövenként 106 sejtet festettünk meg a megfelelo koncentrációjú PE-vel jelölt felületi marker-specifikus mAb (anti-CD3 vagy CD4 vagy CD8) 30 percen keresztül, jégen. Két mosási fázis után a sejteket fixáltuk 4 %-os PFA/PBS-pufferben 20 percig. Ezután a mintákat permeabilizáltuk és festettük a megfelelo koncentrációjú anti-GCR mAb-bal további 30 percig. A permeabilizáló és a mosó pufferben való mosási fázisok után a mintákat mértük és elemeztük egy Becton Dickinson FACS Calibure készülékkel. Ún. „List mode file"-okat elemeztünk FCAP-list programmel (FCAP-list software for Flow Cytometry Data Analysis and Processing, amelyet a Soft Flow Hungary Ltd. 1997. (ISBN 963047843 9). Az anti-GCR FITC festést mindig összevetettük az izotípus-FITC kontrol mintákkal. Megszámoltuk a 18 tagú betegcsoport és a 4 tagú kontrol csoport esetében a CD3, a CD4 és a CD8 pozitív sejteket és azok (CD3, CD4 és CD8 pozitív lymphocyták) glükokortikoid receptor pozitív (GCR+) hányadát. A statisztikai elemzést Student-féle t-próbával és ANOVÁ-val végeztük.

Eredmények

A három klinikai csoport és a kontrollcsoport abszolút adatait, a CD3, a CD4 és a CD8 sejteket valamint mindegyik csoport GCR pozitivitását az 1-4. Táblázat tartalmazza. A CD3, a CD4 és a CD8 arányok, valamint a CD4/CD8-arány nem mutatott összefüggést a szteroid kezelésre mutatott klinikai reakcióval. Bár, a GCR+ sejtek aránya mindegyik csoportban korrelált a szteroid érzékenységgel (1. ábra). Így, a szteroidra jól reagálók GCR+CD4/CD4 aránya 26,11 %, és a GCR+CD8/CD8 aránya 5,42 % volt, míg a nem érzékenyek esetében ugyanezek az arányok 2,52 % és 21,38 % voltak. A két arány összevetése, vagyis a CD4+/CD8+ arányok számítása esetén a szteroidra jól reagálóknál 6,32, a közepesen reagálóknál 1,16 és a rosszul reagálóknál 0,78 volt. A kontrol csoportnál az arány 1,03 volt. A GCR pozitivitás a teljes T-sejt (CD3) csoportban nem mutatott korrelációt a szteroid kezelésre való klinikai válaszkészséggel.

Megbeszélés

1974-ben Shalhoub foglalkozott eloször az idiopathiás nephrosis szindroma és a T sejt funkció zavar összefüggésével. Fodor és társai késobb feltételezték, hogy a gyermekek „minimal change" nephrosis szindrómájában szerepet játszik egy T-sejt funkciót befolyásoló szérumfaktor. Fiser és társai vizsgálták a T-lymphocyta alcsoportokat flow cytometriás elemzéssel nephrosis szindrómában szteroid kezelés alatt és steroid kezelés nélkül.. Vizsgálataik a rendellenes T-sejtvonalak kóroktani szerepére utaltak, de ezeknek a lymphocytáknak funkcionális szerepe nem tisztázódott. Ezeket követoen részletesebben tanulmányozták a nephrosis szindrómában szenvedo, szteroid érzékeny és szteroid rezisztens gyermekeknél a T-sejt elváltozást, és úgy találták, hogy több különbözo immun-mechanizmust muködik közre az idiopatikus nephrosis szindróma patogenezisében. Ismeretes, hogy a glükokortikoid receptorok száma alapveto a glükokortikoid hatás kiváltásában. Ezen túlmenoen, a szteroid érzékenység vizsgálata fontos, mert befolyásolja a kezelési protokollt. Vizsgálatunk arra mutat, hogy a GCR+CD4/GCR+CD8-arány ismerete hasznos alapul szolgál a kezelési lehetoségek értékelésénél. Magas arányok esetében valószínusítheto a szteroid érzékenység, viszont ott, ahol az arány kisebb, mint 2, a szteroid kezelésre nem várható kielégíto válasz. Úgy véljük, hogy a T-sejtvonalak GCR-pozitivitásának elemzése hasznos útmutató a nephrosis szindrómában szenvedo gyermekek személyre szabott kezelésének megválasztásánál a betegségük teljes folyamatában.

 

 

1. ábra - Glükokortikoid kötéssel rendelkezo (GCR+) sejtek (átlag, ± SEM) a CD4 (A) és a CD8 (B) pozitív T-sejteknél. A GCR+CD4+/GCR+CD8+ sejtek arányát mutatja az 1C ábra. 1: szteroid kezelésre jól reagálók, 2: közepesen reagálók, 3: nem reagálók, 4: kontrolcsoport. A részletekrol lásd: Anyag és Módszer. *:p< 0,05, **:p< 0,01 (ANOVA).

 

Copyright @2001 Miami Children's Hospital

About IP | Editorial Staff | Author Guidelines | Search | Subscribe | Contact |

@Copyright 2006 Miami Children's Hospital